réalisation des cupules témoins lors d'un ELISA indirect

[Cracoucass]

Je dois réfléchir sur un protocole ELISA indirect.


Cela concerne une recherche d'anticorps spécifiques, par exemple viraux
ou bactériens.
Les cupules d'une barette sont sensibilisées par l'antigène viral ou
bactérien.

Il s'agit de titrer un échantillon.
On étalonne à partir d'une solution d'anticorps dont le titre est connu,
en effectuant des dilutions successives au demi.

Je n'ai pas compris comment à été choisie la cupule appelée blanc
réactif, située en A1. On me demande de mettre du tampon à la place
d'une solution contenant l'anticorps.

Puis, c'est là que le bât blesse, il ne faut pas ajouter de conjugué
marqué à la peroxydase, ni le chromogène! A la fin on lit la densité
optique en même temps que les autres cupules.


On réalise en A2 un autre témoin appelé témoin de fixation non
spécifiquedu conjugué.
Je suppose, mais c'est à moi de le trouver, qu'il faut mettre du tampon
au lieu d'une solution contenant l'anticorps (étalon ou échantillon
inconnu), puis du conjugué puis du chromogène.

Mes questions sont les suivantes :à quoi sert A1, car A2 semble un
témoin plus pertinent? Quelle densité optique faut il soustraire des
densités mesurées pour l'étalon et l'échantillon? A1 ou A2 ?
Il me semble que A2 est meilleurs.

Merci de vos lumières.

[LaFouine]

Post by Cracoucass
Je dois réfléchir sur un protocole ELISA indirect.
Cela concerne une recherche d'anticorps spécifiques, par exemple viraux
ou bactériens.
Les cupules d'une barette sont sensibilisées par l'antigène viral ou
bactérien.
Il s'agit de titrer un échantillon.
On étalonne à partir d'une solution d'anticorps dont le titre est connu,
en effectuant des dilutions successives au demi.
Je n'ai pas compris comment à été choisie la cupule appelée blanc
réactif, située en A1. On me demande de mettre du tampon à la place
d'une solution contenant l'anticorps.
Puis, c'est là que le bât blesse, il ne faut pas ajouter de conjugué
marqué à la peroxydase, ni le chromogène! A la fin on lit la densité
optique en même temps que les autres cupules.
On réalise en A2 un autre témoin appelé témoin de fixation non
spécifiquedu conjugué.
Je suppose, mais c'est à moi de le trouver, qu'il faut mettre du tampon
au lieu d'une solution contenant l'anticorps (étalon ou échantillon
inconnu), puis du conjugué puis du chromogène.
Mes questions sont les suivantes :à quoi sert A1, car A2 semble un
témoin plus pertinent? Quelle densité optique faut il soustraire des
densités mesurées pour l'étalon et l'échantillon? A1 ou A2 ?
Il me semble que A2 est meilleurs.
Merci de vos lumières.

Salut,

Bon, je ne suis pas un spécialiste d'ELISA.
D'après ce je que j'ai pu lire de ce test,
il semblerait que A1 soit un "témoin négatif"
et que A2, un temoin de "faux-positif".
les cupules contenants les dilutions d'anticorps
soient tes "témoins positifs".

Dans A1, on ne met ni conjugué ni chromogène afin
de savoir si A2 est positif ou non.

A2 permet de connaitre :
* si le conjugué se lie avec l'antiigène
-> toutes les cupules sont "+" sauf A1
(enfin quand je dit "+", la coloration induit un biais dans
la lecture de la densité optique des autres cupules )

* s'il ne se lie pas avec l'antigène
-> pas de biais de lecture.

Pour lire les DO dans autres cupules, il me semble aussi
qu'il faut "soustraire" A2, enfin pour calculer l'index ELISA.
Si les lavages ont bien étés réalisés et si A2 est "-", A2=A1
et si A2 est "+" alors il faut l'utiliser pour les autres DO.

Ca demande un second avis.

@+

[Cracoucass]

Ca me semble raisonnable et cohérent.
Merci encore pour ton aide.